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    山东省农业科学院测序中心
    发布时间:2013-5-10

     

    团队:(Group Members)

    主任:步迅

    博士:张全芳

    技术支持:刘艳艳  杨雪

    科研队伍:梁水美、冯梦秋、孙北京、岳鸣鸣、卞如如、李燕

    科研辅助人员:史学琴、屈宏珊

     

    “山东省农业科学院测序中心”成立于2006年,隶属山东省农科院生物技术研究中心,是以“小麦、玉米国家工程实验室”等十余个国家及省部级重点实验室为依托,建立的高通量基因测序技术平台。测序中心目前拥有1000平方米的专业实验室,配备最先进的Illumina Hiseq/Miseq/ Life Ion Torrent高通量测序系统、ABI3730XL DNA AnalyzerDNA合成仪和荧光定量PCR仪等设备,为高校、科研院所、医学以及农林畜牧渔等生命科学领域的科研和高校等机构,提供专业、精准的科研和技术服务。范围涵盖基因组学、生物信息学、医学分子诊断、环境及能源等科研和应用服务领域。经过多年的技术积累和人才培养,中心拥有一支由海外专家、博士、硕士等各层次技术人员组成的技术团队,并且以三大技术平台为基础,形成了一整套完善的技术服务体系和管理体系。

         历年来,测序中心多次获得山东省大型科学仪器设备协作共用先进单位等表彰奖励。参与了 “973、“863 “农业部转基因专项”等多项国家重大科研项目;还协助完成花生、小麦、油菜等多种农经作物的全基因组测序工作;为农业部DUS中心“基于分子水平的农作物品种资源鉴定标准”的制定提供技术支持;受中国慈善基金会委托承担贫困地区患儿遗传疾病大型筛查等。已经成长为具备一流专业技术能力的大规模基因测序技术服务平台。科研服务范围包括:

     

    一、第一代测序技术平台(ABI3730xl DNA Analyzer 测序中心具备2ABI3730xl DNA Analyzer、一台ABI3100Avant Genetic Analyzer、一台ABI310开展基于Sanger法毛细管测序技术。 

    1.DNA 常规测序(PCR产物/质粒/BAC/Cosmid/Fosmid/Walking测序/EST测序/RNADNA病毒测序/线粒体全长测序/外显子测序等)                            

    2.基因分型检测服务(STR/SSR微卫星分析/SNP多态性检测服务)

    3.基因突变检测服务

    4.基因克隆服务(TA克隆服务/亚克隆服务)

    5.微生物菌种鉴定服务(细菌16SrDNA菌种鉴定/真菌18SrDNA/ITS

    6.基因文库构建服务(cDNA文库构建/Shotgun 文库构建)

    7.BSP法甲基化检测服务

    8.全基因组合成、引物合成服务

     

    二、第二代高通量测序平台(Illumina Hiseq/Miseq; Life Ion Torrent)和生物信息学平台。 

      测序中心依托成熟的第一代测序技术平台,与第二代高通量测序平台相结合,并配备由专业的生物信息学团队,组成了以科研单位为主体的强大的高通量测序技术平台,为生命科学领域的科研和检验机构提供科研课题和项目技术全方位的测序技术服务。 

     

    三、生命科学领域科研合作技术服务平台

    1  提供生命科学领域科研项目的整体方案设计、实验实施、信息分析等技术平台;

    2  基因克隆及表达、转基因实验服务、核酸提取等相关技术平台;

    3  实时荧光定量PCRRT-PCR,Real-Time PCR)技术平台;

    4  相关遗传疾病分子诊断、个性化治疗指导用药等专业技术科研实验平台。

    5  MLPA多重连接探针扩增试剂盒专业检测技术平台。

     

    四、农业科研服务:

    (一)、重要农作物基因检测

    综合当前重要粮食作物基因组学研究现状,针对急需解决的重要作物的基因提供检测和筛查。主要项目:

     

    重要农作物基因检测、筛查项目:

    1. 抗除草剂基因的检测

    2. 六种主要抗除草剂基因的检测

    3. 水稻分子标记辅助育种

    4. 稻瘟病抗性基因、稻米品质和BT型恢复基因等分子标记的总结和开发

    5. 玉米分子标记辅助育种

    费用核算: 根据所委托检验的不同作物种类、采样方式、样品数量、检测方式和客户的具体要求,分别核算。

     

    1.       抗除草剂基因

     抗除草剂Basta基因bar

    抗草甘膦基因aroA

    抗溴苯腈基因bxn

    抗绿磺隆基因csrl

    抗咪唑啉酮基因BnALS1R

    抗阿特拉津基因psbA

    1983年第一个转基因抗除草剂烟草问世以来,在大豆、玉米、小麦、棉花、油菜、亚麻、甜菜、水稻等作物上,培育成功了一系列抗除草剂品种并得到大面积推广。 转基因技术的应用,使作物获得或增强了对除草剂的抗性,从而解决了除草剂的选择性问题,使许多优秀的灭生性除草剂得以广泛使用,也促进了新除草剂的研制与开发。目前,涉及的除草剂主要有草甘膦、草铵膦、磺酰脲类、咪唑啉酮类、溴苯腈、2,4-滴等,抗除草剂与抗虫双价转基因作物也有所发展bar基因是迄今为止用得最多的一个抗除草剂基因,已成功地用于小麦、水稻、玉米、大麦、油菜等作物的转。另外,作为选择标记基因,抗草甘膦的aroA基因、抗溴苯腈的bxn基因和抗绿磺隆的csrl基因等也成功地用于不同作物的遗传转化。

    抗除草剂转基因作物的研究和推广一直处于领先位置。2004年,抗除草剂转基因大豆、玉米、油菜和棉花的种植面积为5860hm2,占转基因作物种植面积的72%,培育抗除草剂作物的研究主要集中于美国各大农药公司或与有关的遗传单位合作研究开发。已商品化的有:抗草甘膦的大豆,玉米、棉花、油菜、向日葵、甜菜、水稻;抗咪唑啉酮的玉米、油菜、甜菜、水稻;抗磺酰腺类的大豆、棉花;抗溴苯腈的棉花、烟草等。中国已获得的抗除草剂转基因作物有抗Basta水稻、小麦、烟草。油菜、芝麻;抗阿特拉津大豆:抗溴苯腈油菜、小麦及抗草甘膦小麦等。  

    近年来,在水稻、玉米、大豆等作物中陆续发现了抗除草剂基因的漂移,对转基因作物安全体系提出了更大的挑战。因此及时建立和完善抗除草剂基因检测体系不仅能加快育种进程培育高产优质作物品种,还能及时对种植转基因作物环境做出反馈,对转基因生物安全提供准确评价。

     

    2.水稻作物重要的相关基因检测:

        随着水稻功能基因组研究的迅速发展,尤其是随着多种分子标记技术的开发与应用,将多个有利性状基因进行导向性聚合,大大简化了检测技术和降低了实验成本,缩短了育种周期。因此,研究和开发更多与抗性、米质和育种进程密切相关的分子标记是现阶段的重要任务。

    2.1 水稻稻瘟病抗性基因

    1 稻瘟病抗性基因功能标记*

     

    抗性基因名称

    功能标记

    标记类型

    引物名称

    1

    Pita (52-53)

    YL183/YL87 YL155/

    SNLP

    YL155/YL87/YL183

    2

    Pit(35)

    tNpb/tK59

    SNLP

    tNpb/tK59

    3

    Pikh(54)

    Pikh

    InDel

    Pikh

    4

    Pil(24)

    Pil-6c

    dCAPS

    Pil-6c

    5

    Pib(29,55)

    Pibdom/Lys145

    SNPL/SNLP

    Pibdom/Lys145

    6

    Pid2(56)

    M-Pid2

    SNP

    d2/d2In/d2

    7

    Pik(42)

    Pik

    dCAPS

    Pik

    8

    Pikp(42)

    Pikp

    dCAPS

    Pikp1/pikp2

    9

    Pikm(57)

    Pikm

    InDel

    Ckm1/Ckm2

    10

    Pid3(38)

    Pikd3

    dCAPS

    Pid3

    11

    Pi25(58)

    Pi25

    CAPS

    CAP2/CAP3

    12

    Pi9(59)

    M-Pi9

    SNP

    Pi9

    13

    Pi2(59)

    M-Pi2

    SNP

    Pi2

    14

    Pi5(59)

    M-Pi5

    SNP

    Pi5

    *徐未未,等.水稻抗稻瘟病基因的分子标记与标记辅助育种研究进展.江苏农业学报,201329(4) :898-906.

     

    稻瘟病是由真菌(Magnaporthe grisea)引起的广泛发生在世界各稻区的主要病害之一,发病后致使产量损失相当严重,在丘陵地区甚至经常出现颗粒无收的现象。目前控制稻瘟病的主要方式是使用农药和培育稻瘟病抗性品种。但是稻瘟菌生理小种具有高度变异性, 病原菌随着抗性基因的利用和布局, 群体遗传结构随即发生变化, 促使新老毒性基因不断交替。一方面使用农药不仅增加水稻生产成本还对环境造成较大污染,传统遗传育种周期长无法对变异稻瘟病生理小种及时做出反馈,挖掘和利用广谱持久抗性基因是水稻防治稻瘟病最经济有效的策略,现代分子标记辅助育种手段就为选育高产、优质、和多抗于一体的品种提供了技术保障。

    20 世纪60年代以来, 已经有越来越多的稻瘟病抗性基因被定位和克隆,并开发出了许多与抗性基因紧密连锁的分子标记或功能标记,利用分子标记辅助育种技术已经培育了许多抗病品种或者品系。截至20138月,已至少报道了68个抗稻瘟病位点共83个主效基因。这些基因成簇地分布于除3染色体外的所有水稻染色体上(2个隐性,其它显性),其中,Pb1, Pia, Pib, Pid2, Pid3, Pik, Pik-h/Pi54, Pik-m, Pik-p, Pish, Pit, Pita, Piz-t, Pi1, Pi2, Pi5, Pi9, pi21, Pi25, Pi36, Pi37, Pi50, Pi56, PiCO39 24个基因已被成功克隆(国家水稻数据中心. 稻瘟病主效抗性基因列表[DB/OL]. http://www.ricedata.cn/gene/gene_pi.htm, 2012-6-20.

     

    2.2 大米品质相关性状基因

       稻米品质改良是水稻育种的重要方面传统的常规育种方法由于缺乏对目标基因有效检测的手段无法对稻米品质的基因型进行有效操作因而品质改良进展缓慢利用分子标记辅助选择与传统育种技术相结合可以在对稻米外观品质进行鉴定的同时对被选个体的基因型进行准确的鉴定结合品质的测定可以大大提高育种效率

    2、淀粉合成相关酶基因多态性分子标记*

     

    基因

    标记

    标记类型

    1

    AGPar M1/ AGPar2

    AGPar

    STS/CAP(Tsp45I)

    2

    AGPiso

    AGPiso M1/M2/M3

    CAPS(BstX I)/STS/CAP(EcoR I)

    3

    AGPsma

    AGPsma M1/M2

    STS/ STS

    4

    Wx

    Wx M1/M2/M3

    STS/ CAPS(Nhe I)/ CAPS(Acc I)

    5

    GBSSII

    GBSSII M1/M2

    STS/ CAPS(EcoR I)

    6

    SSI

    SSI M 1/M2/M3

    CAPS(Nru I)/STS/CAP(Apa I)

    7

    SSII-I

    SSII-I M1/M2/M3/M4

    STS/CAPS(Age I)/STS/STS

    8

    SSII-2

    SSII-2 M1/M2/M3

    STS/STS/STS

    9

    SSII-3

    SSII-3M1/M2/M3

    STS/CAPS(Ban II)/CAPS(Nhe I)

    10

    SSIII-1

    SSIII-1 M1/M2/M3

    SSR/CAPS(EcoRI)/CAPS(NdeI)

    11

    SSIII-2

    SSIII-2 M1/M2

    CAPS(Xba I)/STS

    12

    SSIV-1

    SSIV-1 M1

    CAPS(Nhe I)

    13

    SSIV-2

    SSIV-2/M2/M2/M3

    CAPS(Sph I)/STS/CAPS(Eco72I)

    14

    SBE1

    SBE1 M1/M2/M3/ISA M3

    STS/STS/STS/STS

    15

    PUL 

    PUL M1/M2/M3/M4/M5/M6

    STS/STS/STS/STS/STS/STS

    *田志喜,等:水稻淀粉合成相关基因分子标记的建立。2010,5529):2591  -2601

     

    2.3 恢复基因检测

       优良恢复系选育是提高杂交粳稻优势水平实现其产量突破的重要途径,而快速准确地鉴定恢复基因则是提高其育种选择效率的关键。传统粳稻恢复系选育完全依靠测交来鉴定育种后代中是否存在恢复基因,这一方法不仅需要两个生长季节同时还要对大量单株进行测交。而利用与恢复基因紧密连锁或共分离的分子标记则可以克服上述缺点,有效减少恢复系选育的时间和强度大大提高育种工作的效率。

    BT型细胞质雄性不育恢复基因Rf-1,该基因由两个相关的育性恢复基因Rf1aRf1b组成,二者在穗、叶和根中均有表达,它们编码的蛋白RF1A RF1B 都定位在线粒体上,定向编码线粒体的PPR蛋白,其中Rf1a编码的蛋白RF1A以内切方式切断B-atp6/or f79 mRNA来阻止ORF79蛋白的产生使育性恢复,而RF1B则通过降解B-atp6/or f79 mRNA使育性恢复。在RF1ARF1B同时存在时, RF1A具有优先作用。与可以恢复细胞质雄性不育的近等基因系Rf-1Rf-1,相比,不能恢复育性的近等基因系(rf-1rf-1)Rf1a位点上存在1bp574bp两处缺失。

    陈涛等(2013)根据BT型粳稻不育系和恢复系在Rf1a位点上存在的碱基差异设计了Rf1a的1对插入缺失(insertion-deletion, InDel)功能标记目的就是要建立一种准确快捷的基因型选择方法来鉴定粳稻恢复基因提高恢复系的育种效率。Rf1b cDNA 全长3870bp,在恢复系明恢63中仅含有1个外显子,编码一个由506氨基酸组成的蛋白产物,产物含有PPR基序和线粒体定位信号肽。6个恢复系中的恢复等位基因与6个非恢复系(雄性不育系或保持系)的非恢复等位基因编码的蛋白之间有9个氨基酸的差异,其中共同的差异是恢复等位基因Rf1b 的第1235位碱基A在非恢复等位基因中置换成G,导致第412位的天冬酰胺变成丝胺酸。

      3. 12对恢复基因Rf-1(Rf-1a/ Rf-1b) 相关SSR引物名称 *

     

    引物名称

    1

    OSRRf

    2

    AT801

    3

    AT501

    4

    RM184

    5

    RM258

    6

    RM5629

    7

    RM6100

    8

    RM1108

    9

    RM6691

    10

    RM7300

    11

    68923-7

    12

    RM228

     

    *程保山,等:与粳稻BT型细胞质育性恢复基因连锁的实用SSR标记的筛选。南京农业大学学报, 2 011 , 34( 1) : 1 7

    *陈涛,等:粳稻BT型细胞质雄性不育恢复基因功能标记的开发与应用。中国水稻科学2013273259-264

     

    3.玉米相关重要基因检测:

    3.3 玉米抗性相关基因

    1)粗缩病抗病位点

    4 玉米粗缩病检测位点信息

    位点名称:

    umcl656

    bnlg2191

    umcl401

    umcl666

    bnlgl823

    umcl268

     

    粗缩病是一种世界性玉米病害,1949年在意大利首次发现,此后在阿根廷法国西班牙伊朗等国相继发生1954年,在我国新疆和甘肃地区发现玉米粗缩病。自20世纪60年代以来,我国各玉米产区均有不同程度发生,近年来,随着气候环境变化和种植结构调整,全国( 尤其是黄淮海地区) 玉米粗缩病的发生呈明显上升趋势。目前,粗缩病已经成为我国主要玉米病害之一,对我国玉米生产构成严重威胁。

       我国玉米粗缩病的病原病毒主要是RBSDV 近年来通过序列分析在山东济宁地区的感病玉米植株中发现了SRBSDV SRBSDV是一种新发现的能够引起水稻黑条矮缩病的病毒,在粗缩病玉米植株中发现,说明SRBSDV可同时侵染水稻和玉米,玉米抗粗缩病呈数量性状遗传,由多个数量性状位点( QTL) 控制定位玉米抗粗缩病QTL是克隆抗病基因研究抗病机理的前提,同时可以用来指导抗病育种,提高抗病资源的利用率。

     2)玉米茎腐病

    玉米茎腐病,又称玉米茎基腐病玉米青枯病,是世界范围内玉米主产区内危害严重的一种土传性病害 玉米茎腐病发病情况因年份和地区而异 茎腐病可由多种病原菌单独或复合侵染造成,按其致病菌可将玉米茎腐病主要划分为: 赤霉菌属茎腐病(Gibberella stalk rot)、炭疽茎腐病 (Anthracnose stalk rot)、镰刀菌茎腐病(Fusarium stalk rot)、干腐菌茎腐病(Diplodia stalk rot)、腐霉菌茎腐病(Pythium stalk rot)、黑孢霉属茎腐病(Nigrospora stalk rot)、节壶菌属茎腐病 ( Physoderma stalk rot)、细菌性茎腐病( Bacterial stalk rot) 。其中赤霉菌茎腐病、炭疽茎腐病、镰刀菌茎腐病和干腐菌茎腐病四类茎腐病在玉米生产过程中危害极其严重。串珠镰刀菌常见于干燥温暖地区,在即将抽穗时发生,危害严重;禾谷镰刀菌则流行于冷凉地区,它是茎腐病原中致病力最强的;这两类镰刀菌是玉米茎腐病的主要致病菌。

    茎腐病的抗性遗传机制较为复杂 早期利用由抗赤霉菌茎腐病玉米自交系B89和感病自交系33-16杂交后代所得的150F2:3抗性进行分析,分别在5条染色体上检测到5个抗病QTL位点。Yang等利用抗病自交系1145和感病自交系Y331杂交后代的分离群体,将抗赤霉菌茎腐病主效QTL( qRfg1) 定位到玉米10号染色体上500Kb的区间范围内。Zhang等将抗赤霉菌茎腐病微效QTL( qRfg2) 定位到1号染色体上分子标记SSRZ319CAPSZ459之间的约300Kb的范围内,该定位区间内生长素调节蛋白编码基因被认为是候选基因。Yang等将抗镰刀菌茎腐病基因Rfg1定位到玉米6号染色体上,将抗腐霉菌茎腐病基因Rpi1定位到玉米4号染色体分子标记bnlg1937agrr286之间 并在玉米4号染色体上克隆到了抗炭疽茎腐病的QTL ( Rcg1) ,为典型的NBS-LRR类抗病基因。

    针对玉米粗缩病、茎腐病和小斑病等其他病害,可跟进最新研究进展,提供多个标记基因的分子检测服务。

     

    五、新型SSR/STR分子标记全套服务

    (一)方法介绍

    1.利用3730xl DNA分析仪对荧光标记的DNA片段进行精确检测,结合分子量内标进行DNA片段长度计算,使STR分型更加高效、快捷、精准!                                                                                                 

    2利用新型荧光探针检测技术,大大降低引物成本、提高检测效率!                                                                                                

    本中心已经将该技术应用在玉米小麦、白菜、种猪、种牛等作物和人类的遗传多样性分析基因型鉴定等多项研究中。

    (二)技术体系:

    1 、实验体系的建立

    采用优化的PCR实验模型建立PCR实验体系,使用专业软件迅速建立预实验系统。通过对少量样品的预实验,建立待测样品的最优实验条件和备选实验方案。

    2、三轮PCR实验进程

    独有的3PCR实验进程,确保最大量的样品得到成功扩增,提高样品检测成功率。

    3、高通量ABI 3730xl测序仪精准检测

    以专业的DNA测序服务技术,确保短时间内对大量样品的及时、准确、高效检测分析。

    4、软件数据处理

    ABI GeneMapper 4.0软件,自动完成数据获取和处理分析,分型结果直观可靠。减少人工分析的误差和耗时。

     

    (三)技术流程
    SSR引物开发——> 引物筛选——> 样本批量扩增——> 测序仪检测——> 原始数据分析——> 群体遗传学分析(增值服务)

    (四)收费标准:

    编号

    服务名称

    内容说明

    周 期

       

    SSR01

    微卫星—单色检测

    单色检测,数据分析至size

    5工作日

    800/96孔板

    SSR02

    微卫星—多色检测(三色)

    多色检测,数据分析至size

    5工作日

    1200/96孔板

    SSR03

    微卫星—AFLP跑板

    上机检测,数据分析至01矩阵等

    5工作日

    800/96孔板

    SSR04

    微卫星—STR跑板

    上机检测,不分析数据等

    5工作日

    500/96孔板

    SSR05

    微卫星—普通引物合成

    20DPAGE纯化,不超过30碱基

    5工作日

    60/

    SSR06

    微卫星—荧光引物合成

    FAM   2OD

    HEX   20D

    TMR   2OD

    ROX   2OD

    7工作日

    300/

    400/

    400/

    450/

    SSR07

    微卫星—引物设计

    不含验证

    2工作日

    400/

    SSR08

    微卫星—引物开发

    开发10对多态性引物,取6个样本验证

    3-6

    询价

    SSR09

    微卫星—STR/SSR分型检测

    引物设计合成、扩增、预实验、检测

    4-8

    询价

    SSR10

    微卫星—数据分析

    关联性分析、构建遗传图谱等

    4-6

    询价

     

    (六)送样要求
      细胞(≥106 )、组织(≥300mg)、血液(≥1ml)、基因组DNA(≥20μl,浓度≥50ng/μl);引物信息、片段长度范围、琼脂糖电泳图等。

     

    六、科研合作单位:

     

    山东大学

    山东省医科院

    山东师范大学

    山东省科学院

    中国海洋大学

    山东省农科院作物所

    中科院黄海所、海洋所

    山东省农科院畜牧所

    青岛农业大学

    山东省农科院蔬菜所

    齐鲁师范大学

    山东省农科院家禽所

    山东省齐鲁医院

    山东省农科院水稻所

    山东省立医院

    山东省农科院奶牛中心

    山东省肿瘤医院

    山东省农科院棉花中心

    山东省军区总院

    山东农业大学

    山东省千佛山医院

    中国农科院蔬菜花卉研究所、生物技术研究中心

     

     

    地址:山东省 济南市工业北路202 创新大楼0406-0411室 (测序中心)

    邮箱:sdsequencing@163.comsdgenetest@126.com

    电话:0531-83175033(技术部);0531-83175375(业务部)